水凝胶，又一篇《Nature Materials》!
光固化，可用于扩张显微镜高分辨细胞成像
东谈主眼的分辨率十分有限，需要通过显微镜对细胞等微不雅结构不雅察。然而使用光学显微镜无法对细胞的胞内亚结构进行紧密的不雅察，需要诓骗电子显微镜等更为立志的缔造进行不雅察，这无疑成为了许多经费不及的谋划机构的鼓吹谋划的辞谢。关系词，扩张显微镜（ExM）时期的发明破损了这一处所。扩张显微镜时期是一种基于可扩张的聚电解质水凝胶原位团聚使固定生物标本各向同性扩大的时期。把柄该方法和水凝胶化学方法的不同扩张显微镜不错提供4-20倍的线性放大，从而不错使用传统的共聚焦显微镜对细胞特征进行超分辨率成像。除了细胞成像除外，扩张显微镜时期还不错断根样本，这成心于更复杂的三维（3D）组织样本的成像。现阶段扩张显微镜时期已用于组织学切片的病理筛选、单细胞/分子精度不雅察3D组织样本和亚细胞RNA定位和测定。
迄今为止，扩张显微镜时期中使用的水凝胶主淌若通过使用氧化归附激发剂竣事对丙烯酸酯/基单体进行链团聚而合成。然而，这种政策常常会导致很长的样品制备时辰，并需要一个惰性歧视来缓解氧对激发活性中心的扼制，极端是关于比较薄样品。何况，响应是自觉地进行，因此需要通过仔细的本质筹划竣事对凝胶化时辰的戒指，以幸免在浸透历程中过早的凝胶化。此外，天然链滋长团聚在职何组织细胞中是雷同的，但纳米门径的不均一性会发生，并可能在扩张时增多荧光团位置的空间过失。与蹊径式滋长汇聚比拟，链式团聚水凝胶也具有较差的力学性能，这可能会使扩张后的样品处理复杂化。因此，需要对扩张显微镜时期中所弃取的凝胶进行矫正以克服上述颓势。
近期，科罗拉多大学博尔德分校的Kristi S. Anseth团队为扩张显微时期筹划了一种专用水凝胶（PhotoExM），以减少处理时辰，并竣事样品的均匀扩张。该水凝胶是基于光激发团聚时期，即快速的光激发硫醇/丙烯酸酯搀和花式团聚，这种团聚不受氧气的扼制，并单体向生物样品的扩散（即传质）与水凝胶变成的响应能源学解耦，这在扩张前将细胞镶嵌水凝胶中尤其成心。基于该方法，不错竣事水凝胶中镶嵌的单个细胞的纳米级特征成像，以及竣事与细胞外微环境中更生千里积的（ECM）分子的相互作用的不雅察。该责任以题为“Photo-expansion microscopy enables super-resolution imaging of cells embedded in 3D hydrogels”的著作发表于Nature Materials上。
PhotoExM水凝胶的筹划
PhotoExM水凝胶是通过光激发的硫醇/丙烯酸酯搀和花式团聚制备。该搀和花式响应中的汇聚滋长通过丙烯酰胺、丙烯酸钠（16wt%）和（PEG）-二丙烯酰胺交联剂（PEGdiAcM；Mn = 600 g mol-1）的同期链式滋长共聚进行，再加上多臂PEG-SH和传播的链式滋长解放基之间的链式传递响应竣事蹊径式滋长团聚。与纯正的链式增长汇聚比拟，PhotoExM水凝胶配方的搀和花式响应机制使汇聚交联点的空间位置均匀化，这不错减少扩展后荧光团位置的空间过失。PhotoExM凝胶具有更高的弹性模量，因此与原始的ExM化学比拟，在处理历程中具有更大的抗变形能力。更值得防范的是，将8臂PEG-SH加入到汇聚会所带来的蹊径式增长特质减少了水凝胶变成所需的交联剂（PEGdiAcM）含量，其扩张率不错通过修改PEGdiAcM的分量百分比简陋诊疗。
PhotoExM方法的考据妥协析
为了量化PhotoExM水凝胶的保真度和均匀性，肌细胞（C2C12细胞）被培养在盖玻片上并固定并免疫标志α-管卵白看成不雅察样品。在简单×4.6的样本扩展之后，对调换的区域进行成像。通过谋划样品特征的均方根（r.m.s.），将过失看成平均测量长度的函数。在20微米以上，平均r.m.s.过失为2.8%，这与先前的ExM方法荒谬，但PhotoExM具有更快的团聚能源学（PhotoExM的70秒与ExM的90分钟）。接下来通过量化4.6-6.7倍扩增前后的微管全宽（FWHM）来评估PhotoExM竣事的分辨率晋升。扩增前测量的微管直径为331±32纳米，4.6倍扩增后下落到90±8纳米，6.7倍扩增后为69±7纳米。后者与用一抗和二抗免疫标志的微管的测量直径（d）荒谬（d≈60-65纳米），证据了PhotoExM的超分辨率成像能力。接下来，用PhotoExM来不雅察肌肉组织切片。从6个月大的雄性小鼠身上分离出粗大的胫骨前肌纵向切片，固定后用α-肌动卵白免疫标志，以不雅察肌纤维中的肉眼可见度。在不同的肌肉切片中，在×4.6扩展之前和之后对肌节进行成像，不错对组织样本内的扩展各向同性进行量化。在×4.6扩增前后，肉眼可不雅察到的平均距离隔离为1.43±0.19和6.35±0.81μm（非标单元）。平均肌节长度之间的比率为4.44，对应的过失为3.0%，这在PhotoExM历程的3.5%过失畛域内（×4.6扩展）。此外，PhotoExM还不错被用来揭示分离的肌纤维上的肌肉干细胞（Pax7）和肌纤维-ECM界面（dystrophin）的亚细胞结构，以及肌肉干细胞周围的ECM（层粘连卵白）。
合成水凝胶不错被通俗地用作体内运输系统，以促进组织再生，并看成三维模子在体外谋划疾病和发展。天然三维微环境不错更好地再现细胞在体内的生态位，但对细胞进行高分辨率的分析和成像却更具挑战性。这些问题的出现不仅是因为超分辨率显微镜的穿透深度有限，而且还因为充满细胞的基质的光接管和散射。为了治理其中的一些挑战，通过 PhotoExM时期中的消化才能，使生物样本与稍稍不透明的细胞水凝胶基质平行降解，变成光学上透明的凝胶，随后在成像前进行扩展（GtG政策）。该政策依赖于将PhotoExM身分扩散到三维水凝胶中的能力与凝胶的按需光团聚解耦，从而暂时产生一个相互浸透的汇聚。使用这种基于PhotoExM的GtG方法，初次可视化了东谈主类间充质干细胞（hMSCs）过甚与更生千里积的ECM分子的相互作用。
小结：该文提供了一种用于扩张显微镜时期的光团聚凝胶政策（PhotoExM），这种新式PhotoExM提供了一种浅显而宽广的补充方法，不错治理单体扩散、氧扼制和水凝胶扩张后的脆弱性的问题，并能竣事配方的预搀和，成心于样品的制备。PhotoExM提供了一种精准监测三维微环境中核形势和染色质结构的方法，克服了迄今为止的谋划受到分辨率的限制。更值得防范的是，由于ExM与RNA成像兼容，PhotoExM在改日有后劲竣事准确描摹三维微环境中转录现象的亚细胞和细胞异质性，推动该畛域的发展。
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源泉：高分子科学前沿
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